反義基因技術(shù)（反義基因技術(shù)）

歷史起源

生物的遺傳信息存在于多核昔酸(DNA 或RNA) 分子鏈上, 其堿基互補可形成雙鏈結(jié)構(gòu)。DNA不能直接表達性狀或指導蛋白質(zhì)的合成, 它必須通過轉(zhuǎn)錄mRNA并以此為模板, 合成蛋白質(zhì)。在轉(zhuǎn)錄過程中, 雙鏈DNA中作為模板轉(zhuǎn)錄mRNA的一條鏈稱反義DNA鏈或稱模板鏈。與之互補的另一條非模板鏈, 稱有義DNA鏈。由有義DNA鏈可轉(zhuǎn)錄反義RNA。這種反義RNA分子在調(diào)節(jié)基因表達上有重要作用。

在分子生物學上稱為干擾mRNA的互補RNA( micRNA)?，F(xiàn)代分子生物學對于怎樣產(chǎn)生或利用反義RNA作了深人的研究和探索, 并已取得可喜的進展。新興發(fā)展起來的植物反義基因技術(shù)正是利用或人工合成出一段DNA(或cDNA), 再反向裝上啟動子和終止子, 這樣反向克隆的DNA就能象正常的DNA一樣, 轉(zhuǎn)錄出反義RNA。但這類反義RNA并不能象mRNA那樣, 與核糖體結(jié)合, 翻譯出蛋白質(zhì), 而是以RNA分子形式存在并與靶基因轉(zhuǎn)錄的RNA(包括mRNA)分子, 通過堿基互補, 形成復合體, 從而影響了RNA的剪接、加工以及與核糖體的結(jié)合, 阻止了mRNA正常的轉(zhuǎn)譯和表達, 導致靶基因特異性抑制或產(chǎn)生下向調(diào)節(jié)效果。理想的反義RNA應(yīng)該與靶mRNA具特異互補性。兩者在細胞核中同時存在時, 形成反義RNA-mRNA復合體, 阻止了mRNA由核內(nèi)向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移, 造成特定基因失活或關(guān)閉, 產(chǎn)生所謂特定單基因突變現(xiàn)象。這在遺傳學研究和植物遺傳改良上很有利用價值。

反義RNA理論與技術(shù)的形成和發(fā)展是基于原核生物中天然存在的反義R N A 及其調(diào)控機理的研究而發(fā)展起來的。Tomiazwa于1981年首先報道了反義RNA的分子生物學功能, 他們在研究大腸桿菌質(zhì)粒復制時, 發(fā)現(xiàn)反義R N A 對質(zhì)粒復制有調(diào)節(jié)作用。此后在其它原核生物中也相繼發(fā)現(xiàn)反義RNA對細菌或噬菌體的基因表達、質(zhì)粒復制等起調(diào)節(jié)作用。

分類

反義基因技術(shù)主要包括：反義RNA、反義DNA 及核酶。

根據(jù)反義RNA 的作用機制可將其分為3 類:

I類 反義RNA 直接作用于靶mRNA 的SD 序列和( 或) 部分編碼區(qū), 直接抑制翻譯, 或與靶mRNA 結(jié)合形成雙鏈RNA, 從而易被RNA 酶Ⅲ降解;

Ⅱ類 反義RNA 與mRNA 的非編碼區(qū)結(jié)合, 引起mRNA 構(gòu)象變化, 抑制翻譯;

Ⅲ類 反義RNA 則直接抑制靶mRNA 的轉(zhuǎn)錄。

反義DNA 是指一段能與特定的DNA 或RNA以堿基互補配對的方式結(jié)合, 并阻止其轉(zhuǎn)錄和翻譯的短核酸片段, 主要指反義寡核苷酸, 因更具藥用價值而倍受重視。

核酶( Ribozyme) 是具有酶活性的RNA, 主要參加RNA 的加工與成熟。天然核酶可分為4 類:

I類異體催化剪切型, 如RnaseP;

Ⅱ類自體催化的剪切型, 如植物類病毒、擬病毒和衛(wèi)星RNA;

Ⅲ類 第一組內(nèi)含子自我剪接型, 如四膜蟲人核26S rRNA;

Ⅳ類 第二組內(nèi)含子自我剪接型。

作用原理

反義RNA 是通過靶RNA 進行堿基配對結(jié)合的方式參與有關(guān)的基因表達的調(diào)控。目前推測的反義RNA 作用方式有與mRNA 結(jié)合形成的二聚體阻斷了核糖核蛋白體同mRNA 的結(jié)合, 從而達到了阻斷翻譯的目的; 與mRNA 的結(jié)合阻斷了mRNA 向細胞質(zhì)的運輸; 與mRNA 的結(jié)合使得mRNA 易被酶識別而降解。目前尚不清楚是否還有其它的作用方式存在。

常見的獲得反義RNA 的方法與基因工程方法相同。首先, 以mRNA 為模板合成互補配對的一條DNA 鏈, 然后以合成的互補DNA 為模板合成互補配對的另一條DNA 鏈, 此雙鏈DNA 片段就是目的基因片段, 將目的基因片段反向插入適當?shù)妮d體中, 然后將重組載體導入細胞, 當重組載體基因表達時, 由于是反向插入。因此, 啟動子引導的不是目的基因的轉(zhuǎn)錄, 而是與目的基因互補配對的反義基因的轉(zhuǎn)錄, 從而得到反義RNA, 在實際應(yīng)用中, 構(gòu)建的反義基因常常只是目的基因的5′端與3′端的部分互補堿基配對序列, 但長度一般至少要大于50 bp。

植物中的應(yīng)用

關(guān)于反義基因技術(shù)的研究開始也集中在原核生物, 直到真核生物自然反義系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)，特別是Izant 等首次證實人工構(gòu)建的反義寡核昔酸在真核生物中具有生物學效應(yīng)以來, 反義技術(shù)在真核生物中的研究才得以迅速發(fā)展。隨其研究而發(fā)展形成的反義技術(shù)提供了一種更為直接有效的人為控制基因表達的方法而倍受生物學界關(guān)注。目前在植物領(lǐng)域的應(yīng)用尤為凸顯。

調(diào)控果實成熟

利用DNA 重組技術(shù), 人工構(gòu)建反義基因與反義RNA 系統(tǒng), 調(diào)控生物體內(nèi)特定基因的表達進而延長植物果實貯藏保鮮, 已成為果蔬貯藏保鮮研究工作中最活躍的領(lǐng)域之一。

改良作物品質(zhì)

隨著生活水平的提高和科學技術(shù)的進步, 人們對稻米等糧食作物食用品質(zhì)的要求也越來越高。利用反義RNA 技術(shù)就可以通過對waxy 基因的遺傳操作降低水稻生物體內(nèi)特定基因表達水平, 來控制水稻中直鏈淀粉的合成, 從而改變其在胚乳中的相對含量, 達到改良稻米淀粉品質(zhì)和食用品質(zhì)的目的, 培育優(yōu)質(zhì)水稻新品種。

獲得作物

雄性不育系( 母本) 對提高作物雜交育種效率和效果有非常重要的作用; 是作物雜交育種的技術(shù)關(guān)鍵, 常規(guī)的方法很難得到。目前, 用反義RNA 技術(shù)來獲得雄性不育的轉(zhuǎn)基因植株, 或恢復植株的雄性育性的研究工作在不同植物中取得了積極的成果, 對在雜交種子生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了重要的技術(shù)支持。

改變植物花色

植物的花色在園藝和商業(yè)上有重要價值, 改變花色一直是園藝學家們孜孜以求的目標。研究表明許多植物花的顏色與類黃酮有關(guān), 苯基苯乙烯酮合成酶( CHS) 是類黃酮生物合成中起關(guān)鍵作用的酶；這為利用基因工程調(diào)控花色提供了理論依據(jù)。

增強

反義技術(shù)的建立擴展了機體抵御外來微生物的經(jīng)典免疫學概念, 利用反義RNA 技術(shù)來阻斷細菌、病毒在細胞中的復制, 20 世紀80 年代末期開始應(yīng)用于植物抗病的研究。其原理概括就是選擇細菌、病毒復制過程中的關(guān)鍵基因作為靶基因, 利用反義技術(shù)將其反義基因或片斷轉(zhuǎn)化進入植物細胞，并使其轉(zhuǎn)錄的RNA 結(jié)合靶基因的mRNA, 使靶基因不能正常表達, 從而達到干擾抑制細菌、病毒復制, 提高植物抗病能力的目的。經(jīng)過不斷完善, 反義技術(shù)在植物抗細菌、病毒的研究中得到了廣泛地利用, 己經(jīng)取得了積極的效果。

油料作物種子中脂肪酸合成的控制

在改變油料作物油脂的組成方面，近10年來已取得一系列重大突破, 其主要目的是增加飽和脂肪酸的含量或減少飽和脂肪酸的含量。利用反義基因技術(shù)將反義丙酮酸羧化酶(PEP基因)導入油菜, Anti-PEP轉(zhuǎn)化株含油量比對照明顯提高，最高的幾株均增加了15%以上，并且驗證了蛋白質(zhì)含量與油脂含量呈顯著負相關(guān)。